荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒分析

荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒分析

邱海山1严慧芳2潘俊辉1钟妙容1

【中图分类号】R512.6【文献标识码】A【文章编号】1672-3783（2010）03-0056-04作者简介:邱海山(1976.4-),男,本科,学士学位,职称:主管检验师主要从事生化免疫工作。

【摘要】目的:对聚合酶链反应（FQ-PCR）检测乙型肝炎病毒进行分析，了解其临床应用价值。方法:用中山医科大学达安基因诊断中心设计的HBV-FQ-PCR试剂盒对101份临床血清标本同时进行PCR荧光定量和ELISA肝炎标志物检测，对检测结果进行分析。结果经过FQ-PCR检测，24份HbsAgHbeAgHbcAb都阳性的标本，其血清HBV-DNA也全部阳性，HBV-DNA拷贝数范围在1.4×105-7.0×109/ml之间；32份HbsAgHbeAbHbcAb都阳性的标本，阳性率为46.9%，HBV-DNA拷贝数范围在0-8.1×107/ml之间；14份HbsAb阳性的标本，阳性率为7.1%，HBV-DNA拷贝数范围在0-5.0×104/ml之间；18份全阴性的标本，阳性率为5.6%,HBV-DNA拷贝数范围在0-4.9×105/ml之间。结论FQ-PCR定量检测HBV-DNA灵敏度，特异性较高，能基本反映乙肝病毒在体内的真实复制情况，具有较高的临床应用价值。

【关键词】聚合酶链反应;定量;HBV-DNAFluorescencequantitativepolymerasechainreactionanalysisofhepatitisBvirus

QiuHaishan1YanHuifang2PanJunhui1ZhongMiaorong1

【Abstract】Objective：ToevaluatethesignificanceofPolymerasechainreaction(FQ-PCR)detectionofhepatitisBvirus,Toexploreitsclinicalvalue.Methods:DaanwithGeneDiagnosisCenter,ZhongshanMedicalUniversity,designedbyHBV-FQ-PCRkitfor101clinicalserumsamplesatthesametimefluorescentquantitativePCRandELISAdetectionofhepatitisBmarkers，Testresultsforanalysis.Results:24HbsAgHbeAgHbcAgserumsampleswerepositiveforHBV-DNAareallpositive，HBV-DNAcopynumberintherangeof1.4×105-7.0×109/mlbetween；32HbsAgHbeAbHbcAbarepositivesamples,Thepositiveratewas46.9%,HBV-DNAcopynumberbetweentherangeof0-8.1×107/ml;14HbsAbpositivespecimens,thepositiveratewas7.1%,HBV-DNAcopynumberbetweentherangeof0-5.0×104/ml;18specimenswereallnegative,thepositiveratewas5.6%,HBV-DNAcopynumberintherangeofbetween0-4.9×105/ml.Conclusion:FQ-PCRquantitativedetectionofHBV-DNAsensitivity,specificallythehigher,canbasicallyreflectthehepatitisBvirusreplicationinthebodyoftherealsituation,withahighclinicalvalue.

【Keywords】Polymerasechainreaction;Quantitative;HBV-DNA乙型肝炎病毒（HBV）DNA的检测目前主要依赖聚合酶链反应（PCR）技术，但普通PCR还存在一些不足，使其在临床的应用受到限制。而实时荧光PCR方法（FluorescenequantitayivePCR,FQ-PCR）由于采用荧光技术和闭管检测，不需传统电泳程序，由计算机自动分析定量，且可克服常规PCR扩增产物污染的弊端。[1]本文中用HBV-DNA荧光定量PCR检测试剂盒,测试了101份临床血清标本并同时用酶联免疫吸附(ELISA)进行对照检测,了解其应用价值。

1材料与方法

1.1临床资料：收集2009年8至2009年12月来我院门诊和住院部就诊的已确诊的急性乙型肝炎患者的血清标本8例，慢性乙型肝炎患者血清标本15例，重度乙型肝炎患者血清3例，原发性肝癌患者血清8例，肝硬化患者血清8例，其他患者血清32例，健康体检者血清27例，共101例。

1.2方法：

1.2.1仪器:美国PE7700自动荧光PCR仪。

1.2.2试剂:HBV-FQ-PCR试剂盒由中山医科大学达安基因诊断中心生产；ELISA试剂盒由珠海丽珠集团丽珠试剂厂生产。

1.2.3HBV-DNA检测

1.2.3.1原理:在普通PCR扩增体系中加一个与靶基因序列特异互补的双荧光标记探针，5’端标记荧光发射集团，3’端标记荧光淬灭集团，当探针完整时，后者不发光，有靶基因存在时，在PCR复性阶段探针与靶基因互补，PCR延伸中，由于Tag酶有5’-3’外切酶活性，[2]引物沿模板延伸至标记探针结合处，将近5，端报告基因切下产生荧光，其强度与PCR产物成正比关系。荧光光谱分析仪可测得定量结果，它可反应原始模板的量。FQ-PCR仪通过全程动态监测可以得到一个样品实际扩增曲线以找到PCR扩增的对数期，比较标准样品的对数期，得出每一样品特定模板DNA的起始拷贝数/ml，定量范围为0-1010/ml，定量准确度为±100%。

1.2.3.2操作：将标本洗涤液化12000r/min离心5min,去上清液,采用常规碱裂解法提取HBV-DNA,各反应管放入PE7700自动荧光仪,按下列条件扩增73℃2min预变性,然后按下列条件扩增:93℃45s-55℃120s，共做40个循环，反应结束以后，电脑自动计算出定量结果。

1.2.4肝炎标志物酶联免疫吸附（ELISA），原理及步骤按试剂说明书。

1.2.5统计学方法：采用SAS统计软件进行统计学处理，计数资料比较采用t检验，阳性率比较采用x2检验。

2结果

2.1101例血清标本FQ-PCR检测HBV-DNA结果与检测结果比较，见表1。

24例HbsAgHbeAgHbcAb阳性的标本，FQ-PCR检测HBV-DNA全部阳性，阳性率为100%；18例全阴性的标本1例阳性，阳性率为5.6%；32例HbsAgHbeAbHbcAb阳性的标本15阳性，阳性率为46.9%;14例HbsAb阳性的标本阳性率为7.1%，表明该试剂盒相对于乙肝血清免疫指标的假阳性，假阴性率比较低，灵敏度较高。HbsAgHbeAgHbcAb阳性组平均HBV-DNA拷贝数为7.4×108，HbsAgHbeAbHbcAb阳性组HBV-DNA拷贝数为1.1×107，HbsAb阳性组HBV-DNA平均拷贝数为5.0×104，表明FQ-PCR检测HBV-DNA结果能反应病程的发展。

2.2FQ-PCR检测HBV-DNA结果与临床的关系,见表2。

8例急性乙肝患者血清标本FQ-PCR检测4例阳性,阳性率为50.0%;15例慢性乙肝患者,8例肝癌患者,3例重度乙肝患者,8例肝硬化患者FQ-PCR检测阳性率在62.5%-100%之间,显著高于其他患者组(15.6%),表明FQ-PCR检测HBV-DNA结果可以用于指导临床。

2.332例HbsAgHbeAbHbcAb阳性患者标本FQ-PCR检测结果与临床诊断关系,见表3。表1FQ-PCR检测HBV-DNA结果与检测结果比较

3讨论

乙型病毒性肝炎是严重危害人民身体健康的疾病。诊断乙型肝炎及了解病毒复制状态的检测指标主要包括两部分：一为病毒DNA的表达物及其抗体应答系统，二为病毒DNA。ELISA方法一直是临床诊断HBV感染的传统手段，它就是检测病毒的DNA的表达物及其应答系统。目前认为，乙肝病毒在体内活跃复制是激发机体免疫损害的关键，研究发现，可以HBV-DNA血清浓度的变化赖评价药物疗效与病毒载量的关系[3]，所以检测HBV病毒自身可更灵敏准确地反应HBV感染和治疗恢复情况。聚合酶链技术(PCR)是目前检测HBV-DNA最敏感的方法，但是普通PCR技术普遍存在因PCR后处理过程而产生PCR假阳性污染及PCR非特异性扩增使定量准确性难以提高等问题，而FQ-PCR技术融合了PCR探针杂交技术的优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化，根据酶动力学特点获得DNA模板的准确定量结果。[4]该技术整个实验过程均在完全闭管的状态下进行，无需PCR后处理及冗长的电泳，紫外及染色检测，比较好地解决了常规PCR实验不能准确定量及扩增物污染而导致的假阳性，操作繁琐以及强烈致癌物溴化乙定对操作人员的危害和污染环境的问题，为定量PCR全面进入临床提供了可靠的方法。

文献报道FQ-PCR检测HBV-DNA的结果相对乙肝血清免疫指标的假阳性率和假阴性率均为0，检测HbsAgHbeAbHbcAb阳性标本的阳性率为73%。[1]本文对24例HbsAgHbeAgHbcAb阳性的标本用FQ-PCR检测HBV-DNA全部阳性，假阴性率为0，与文献报道一致。18例全阴性的标本检测有1例阳性（4.9×105/ml），假阳性为5.6%，32例HbsAgHbeAbHbcAb阳性的标本检测15例阳性，阳性率为46.9%，低于文献报道的结果，但仍显著高于常规PCR的阳性率（P<0.05）。[1]本文结果与文献出现偏差的原因可能有以下几点：(1)微溶血标本会影响结果的准确性。(2)干扰素治疗后病毒DNA复制受抑制，PCR检测结果可呈阴性，而HbsAg和HbeAb可能尚未转阴。(3)处于“窗口期”的标本若ELISA检测HbcAb时稀释倍数过大会出现全阴的结果，而“窗口期”病毒仍可能存在低水平复制。(4)当HBV的X区发生变异使HBV处于低水平复制［5］。(5)实验过失。（本文所用HBV和PCR试剂盒参加2009年第一季度卫生部临检中心室内质评符合率为100%）。

标志感染期的血清HbsAgHbeAgHbcAb阳性的标本FQ-PCR定量平均拷贝数为7.4×108。标志恢复期或病毒携带状态的血清HbsAgHbeAbHbcAb均阳性的标本定量平均值为1.1×107，可见FQ-PCR可以反应乙肝患者的病情变化。

2例HbeAbHbcAb阳性的标本FQ-PCR检测有1例阳性（4.0×103），14例HbsAb阳性的标本检测到1例阳性（5.0×104）。这符合关于少数HbsAg阴性的患者体内病毒仍存在低水平复制的观点，[5]也证明FQ-PCR灵敏度高。

8例诊断为急性乙型肝炎的患者的血清标本FQ-PCR检测阳性为4例，阳性率为50%,定量平均拷贝值为1.6×106，这与文献报道的急性乙肝患者体内HBV-DNA含量显著低于慢性乙肝，乙肝后肝硬化和原发性肝癌患者含量的结果相符。诊断为慢性乙型病毒性肝炎，重度乙型病毒性肝炎，肝癌，肝硬化的患者的血清标本FQ-HBV检测HBV-DNA阳性率分别为73.3%，66.7%，100%，62.5%,都显著高于其他病人组（15.6%）（P<0.05）。3例重度乙肝患者检测到1例阴性，定量范围在0-1.4×105，量偏低，这可能与重度乙肝患者使用干扰素治疗有关。

本文对比了15例HbsAgHbeAbHbcAb阳性，FQ-PCR检测也阳性的患者与17例HbsAgHbeAbHbcAb阳性而FQ-PCR检测HBV-DNA阴性的患者的临床诊断，发现HBV-DNA组有13例被诊断为乙型肝炎，肝癌或肝硬化而HBV-DNA阴性组只有5例，存在明显差异（P<0.05）。这提示FQ-PCR能准确反应病毒的复制情况，为HbsAgHbeAbHbcAb患者提供了一个很有价值的诊断指标。

参考文献

[1]程钢、何蕴韶、周新宇.荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒.中华医学检验杂志［J］，1999，22（3）：135-138

[2]HollandPM.AbramsonRD.WatsonRDetectionofspecificpolymerasechainreactionproductbyutilizingthe5’to3’exonucleaseactivityofthethermusaquaticusDNApolymerase.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1991,88:7276-7280

[3]沈敏、张庆五、谈秋雯,等.PCR定量测定血清HBV-DNA的评估.胃肠病学［J］，1999，4（1）：55-56

[4]赖宏芳、付晓野、董玉琳，等.荧光探针定量PCR检测HBVDNA［J］.上海：上海医学检验学杂志，2000，15(1)：1819

[5]WeinbergerKM,ZoulekG,BauerT,etal.AnoveldeletionmutantofhepatitisBvirussurfaceantigen.JmedVirol,1999,58:105

作者单位：516002广东省惠州市第三人民医院检验科1

516002广东省惠州市惠州区计划生育服务站2