简介:为了研究骨髓腔内注射(IBM)异基因间充质干细胞(MSC)对造血干细胞移植后大鼠骨髓MSC重建的作用,研究供体MSC植入状态以探讨MSCs的作用机制,将雌性F344胎鼠及新生鼠外周血(FNPB)及雄性F344大鼠BrdU标记骨髓MSC共移植入经致死量^60Coγ射线预处理的雌性Wistar大鼠,其中FNPB均由IBM输注,MSC则通过IBM或尾静脉注射。观察受鼠存活状况、供体HSC植入水平及骨髓MSC恢复情况,并以PCR检测Y染色体和免疫荧光法检测受鼠骨髓MSC的来源。结果显示:两个FNPB+MSCs共移植组大鼠移植后60天均100%存活,两组比较生存率和供体HSC植入水平无统计学差异,但明显优于单纯FNPB移植组;移植后30天时各移植组受鼠骨髓MSC的增殖能力均未达正常水平,但MSC骨髓腔共移植组集落数(66.0±10.6)明显优于MSC骨髓腔和静脉共移植组及单纯FNPB移植组(P〈0.01);移植后60天时,免疫荧光法检测供体BrdU标记的MSC显示仅在少部分受体发现供、受体源性MSCs嵌合,但两个共移植组存活受鼠均检测到供体MSC来源Y染色体。结论:异基因MSC输注可促进造血干细胞移植受者骨髓MSC恢复,尤以IBM输注为佳。
简介:摘要目的探索在体外培养和纯化SD大鼠的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法。方法采用改良全骨髓贴壁方法,分离和纯化3~4周的大鼠BMSCs,镜下连续观察细胞的形态变化。流式细胞仪鉴定其表面抗原CD11b、CD45和CD90的表达情况。结果原代培养的细胞呈圆形和梭形等,24小时后大部分细胞均贴壁。8~10天可达80%~90%融合,纯化后传代周期为6~8天。流式细胞术鉴定表明CD11b和CD45阴性,CD90阳性。结论改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞,是一种比较理想的分离培养方法。
简介:摘要目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定,为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞,观察细胞的形态及生长特性,并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时,细胞开始贴壁,胞体呈圆形或多边形,培养第3-5天,细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形,培养第7天开始观察到细胞分裂,随着细胞数的增加,细胞的生长速度变快,逐渐成漩涡状排列,培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%,并融合成片。传代后细胞生长迅速,培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45,但表达CD29、CD44,纯度分别为73.8%、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞,随传代数增加,其纯度增加,且该方法简单、实用。
简介:目的研究骨髓间充质干细胞(MSC)对脐带血(CB)CD34^+细胞体外增殖和造血重建能力的影响。方法取人骨髓单个核细胞贴壁培养.梭形细胞完全融合后传代,用流式细胞仪检测免疫表型;将CBCD34^+细胞接种到MSC或其他培养液中.比较不同培养条件对造血干细胞扩增能力、集落形成能力及黏附分子表达的影响。结果在加入IL-3的培养体系中.在MSC和细胞因子作用下,CD34^+细胞扩增7d和14d后,有核细胞(NC)、CD34^+细胞和CDl33^+细胞数,实验组均显著多于对照组。CD34+细胞在未加入IL-3的培养体系中培养8d后,实验组NC、CD34^+细胞、CD34^+CD38-细胞和造血祖细胞集落扩增倍数均显著高于对照组。扩增后CD34^+细胞的ALCAM、VLA-α4、VLA-α5、VLA-β1、HCAM、PECAM和LFA-1表达较扩增前无显著变化。结论MSC可为造血干细胞(HSC)体外扩增提供适宜的微环境,有助于CD34^+细胞体外增殖并抑制HSC分化,保持其造血重建潜能和归巢能力。
简介:目的:分离、培养、纯化家猫的骨髓间充质干细胞,并对获得细胞的表面标志物进行鉴定,为进一步利用骨髓间充质干细胞的细胞移植实验奠定基础。方法:采用全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化家猫骨髓间充质干细胞,通过多次更换培养液获得较纯化的骨髓间充质干细胞,倒置相差显微镜下对细胞形态进行观察;根据第1、3、5、7、9代细胞的镜下增殖情况绘制出生长曲线;通过流式细胞仪检测细胞表面标志抗原CD34、CD44和CD90的表达率。结果:在倒置相差显微镜下观察,分离培养的骨髓间充质干细胞贴壁呈梭形或纺锤形;原代细胞生长丛集成片,5~7d达到融合,进行传代;培养到第三代以后,细胞出现相对均匀的梭形扁平外观,迅速增殖的细胞呈涡流样排列;第3、5代骨髓间充质干细胞增殖能力强于第7、9代;采用流式细胞仪分析结果显示细胞的CD34、CD44和CD90阳性率分别为17.5%、97.9%和91%,这与骨髓间充质干细胞表面抗原的表达一致。结论:分离培乔的细胞具有骨髓间充质干细胞特性,成分相对单一,第3、5代细胞纯度高,增殖能力强,适用于进一步的实验研究.
简介:摘要目的探讨人骨髓间充质干细胞体外培养的可靠方法。方法采用人手术切下的骨头标本,运用全骨髓贴壁法分离培养hBMSCs;观察并绘制生长曲线;取生长状态良好的第四代细胞,通过形态学、流式细胞仪检测表面标志物等鉴定hBMSCs;诱导hBMSCs分化为成脂肪细胞,鉴定本实验所分离的hBMSCs是否具有多向分化能力。结果第四代细胞CD29和CD44阳性表达率分别为100%和99.8%,CD31和CD45阳性表达率分别为0.8%和0.4%。流式细胞仪检测证明本研究分离培养hBMSCs的方法可以获得高纯度的间充质干细胞。hBMSCs体外诱导向脂肪细胞分化16d后,镜下可见胞浆内充满圆形脂滴,油红O染色阳性,诱导成脂肪细胞分化率为85.1±3.2%,证实本实验分离的hBMSCs具有多向分化能力。结论采用手术切下的骨性关节炎标本,运用全骨髓贴壁法可获得稳定、均质性良好的hBMSCs,并具有多向分化能力。本方法能为临床上分离、培养人骨髓间充质干细胞提供了另一种可靠的路线。
简介:目的探讨体外分离、传代培养大鼠骨髓问充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)的方法,并对培养细胞进行初步鉴定,为利用大鼠骨髓MSCs进行感音神经性聋细胞移植治疗的研究奠定基础。方法用贴壁培养法分离大鼠骨髓细胞,第1组于24小时全量换液,第2组于24小时半量换液,第3组于3天全量换液,传代扩增。相差显微镜进行形态学观察;RT—PCR检测培养细胞表面分子表达;定向诱导培养细胞向成脂细胞、成骨细胞方向分化。结果24小时首次全量换液组培养7天后观察见少量细胞集落,细胞形态不规则;24小时首次半量换液组培养7天后观察见较多细胞集落,细胞规则,呈梭形、椭圆形;3天首次全量换液组培养7天后观察见较多悬浮细胞.与贴壁细胞混杂在一起。培养细胞表面分子SH2、CD31、CD44呈阳性表达,但不表达CD34。第2组培养细胞传代后加入不同诱导剂定向诱导分化一定阶段,分别经油红O及VOFIKossa法染色鉴定证实MSCs可分别向脂肪细胞及成骨方向分化。结论本实验分离培养的大鼠骨髓原代细胞24小时首次半量换液培养利于大鼠骨髓MSCs的分离和纯化,可稳定表达SH2、CD31、CD44。MSCs具有多项分化潜能。
简介:目的研究体外大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞等不同组织细胞多向分化的潜能。方法从SD大鼠股骨骨髓中获得间充质干细胞,原代培养后1:2传代,传至第5代后分为普通传代培养组、神经细胞诱导组、成骨细胞诱导组和脂肪细胞诱导组。倒置相差显微镜下观察各组细胞生长情况、形态变化以及矿化结节和脂肪细胞的形成;流式细胞检测第5代大鼠骨髓间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD90、CD31、CD34、CD45;免疫组织化学检测普通传代培养组和神经细胞诱导组细胞巢蛋白、微管相关蛋白-2、胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶等神经细胞相关蛋白的表达情况。结果大鼠骨髓间充质干细胞呈贴壁生长,细胞扩增至第5代时形态趋于一致,呈梭形。大鼠骨髓间充质干细胞表面抗原CD29(99.83%)、CD44(99.77%)、CD90(99.86%)均呈阳性表达,CD31(O.83%)、CD34(1.78%)、CD45(2.90%)无表达。在体外,普通传代培养细胞仅巢蛋白呈阳性表达;由神经细胞诱导的细胞巢蛋白、微管相关蛋白-2、胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶均呈阳性表达.且形态类似神经细胞;由成骨细胞诱导的细胞质内可见矿化结节形成:由脂肪细胞诱导的细胞质内出现多个猩红色呈簇状的脂肪滴。结论大鼠骨髓间充质干细胞易于提取、纯化和扩增,可于体外自发表达神经干细胞标志蛋白.并可通过诱导向神经细胞、成骨细胞及脂肪细胞分化。提示骨髓间充质干细胞不仅具有多向分化潜能.而且可能具有自发向神经干细胞分化的特性。
简介:目的探讨经鼠尾静脉移植的骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)对大鼠痛风肾的影响,具体为延缓上皮到间叶组织转化(EMT)、促进肾脏细胞分化和生长,以及抗氧化应激等方面的作用。并进一步研究其相应的机制。方法幼年雄性Wistar大鼠随机分为正常组和造模组,造模组采用腺嘌呤200mg/(kg?d)灌胃4周制作痛风肾大鼠模型,造模成功24h后,造模组再次被随机分为3组,分别为磷酸盐缓冲液模型组和BM-MSCs治疗组,BM-MSCs治疗组经鼠尾静脉移植入骨髓间充质干细胞(BM-MSCs是经密度梯度离心法结合贴壁筛选法在体外分离培养而成),同时磷酸盐缓冲液(PBS)模型组经鼠尾静脉注入相同量的PBS。注射6周后,收集大鼠的血液和尿液标本用来测定血肌酐、尿素氮和24h尿蛋白含量;对大鼠肾石蜡标本切片进行H-E染色、糖原染色和马松染色,观察并半定量评分评价各组肾病理情况;免疫组织化学法测定大鼠肾石蜡标本切片中的转化生长因子β1(TGF-β1)的表达水平,Western-Blot法测定肾组织中P38蛋白、P-P38蛋白、硫氧还蛋白还原酶1(TrxR1)的表达情况。数据经过正态性及方差齐性检验后,正常组和造模组两两比较采用LSD-t检验,3组之间比较采用单因素差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。结果经腺嘌呤诱导制作的痛风肾大鼠相比正常组大鼠出现明显的肾功能降低,大量蛋白尿以及肾间质和肾小管尿酸结晶沉积,肾间质纤维化、炎症细胞浸润、肾小管上皮细胞坏死、肾小球硬化等,提示痛风肾模型制造成功,并出现了慢性肾功能衰竭;BM-MSCs治疗组较PBS模型组而言,血肌酐水平降低[(88.90±7.89)μmol/Lvs.(117.40±6.13)μmol/L],尿素氮降低[(7.85±0.88)mmol/Lvs.(10.97±1.03)mmol/L],24h尿蛋白减少[(27.72±4.90)mgvs.(54.66±6.72)mg],TGF-β1表达减少[(11.00